Kaedah penyelidikan biologi molekul dan penggunaannya

biologi molekul kaedah penyelidikan memainkan peranan penting dalam perubatan moden, sains forensik, dan biologi. Terima kasih kepada kemajuan dalam kajian DNA dan RNA, orang itu dapat meneroka genom organisma menentukan agen penyebab, untuk mengiktiraf asid nukleik yang dikehendaki dalam campuran asid, dan lain-lain

kaedah molekul biologi. Apa yang ia?

Kembali pada 70-80s saintis adalah yang pertama untuk mentafsirkan genom manusia. Acara ini memberi dorongan kepada pembangunan kejuruteraan genetik dan biologi molekul. Kajian sifat-sifat DNA dan RNA bermakna bahawa ia kini mungkin untuk menggunakan asid nukleik untuk tujuan diagnosis penyakit, gen pengajian.

Penyediaan DNA dan RNA

Molekul biologi kaedah-kaedah diagnosis memerlukan bahan permulaan: sering ini asid nukleik. Terdapat beberapa cara untuk memilih bahan-bahan ini dari sel-sel organisma hidup. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangan, dan ia perlu dipertimbangkan apabila memilih satu kaedah mengasingkan asid nukleik dalam bentuk tulen.

1. Penyediaan DNA oleh Marmur. Kaedah ini terdiri dalam merawat campuran bahan-bahan alkohol, mendakan menyebabkan DNA tulen. Kelemahan kaedah ini ialah penggunaan bahan-bahan menghakis, fenol dan kloroform.

2. Pengasingan DNA pada ledakan. Bahan utama yang digunakan di sini - adalah guanidine tiosianat (GuSCN). Ia menggalakkan pemendapan asid deoksiribonukleik pada substrat khusus, dari mana ia boleh kemudiannya dikumpul melalui penampan khas. Walau bagaimanapun GuSCN - adalah perencat daripada TCP, dan juga sebahagian kecil daripada yang mendapat disimpan di DNA boleh mempengaruhi perjalanan tindak balas rantai polimerase, yang penting apabila bekerja dengan asid nukleik.

3. Pemendakan kekotoran. Kaedah ini berbeza daripada yang sebelumnya kerana molekul sendiri tidak didepositkan asid dehoksiribonukleinovoy dan kekotoran. Untuk melakukan ini, menggunakan penukar ion. kelemahan adalah bahawa tidak semua bahan boleh menyelesaikan.

4. pemeriksaan Mass. Kaedah ini digunakan dalam kes-kes apabila anda tidak perlu mempunyai maklumat yang tepat mengenai struktur molekul DNA, dan keperluan untuk mendapatkan beberapa statistik. Sebabnya ialah bahawa struktur asid nukleik boleh rosak apabila mengendalikan bahan pencuci, terutamanya alkali.

Klasifikasi kaedah penyelidikan

Semua kaedah molekul biologi penyelidikan dibahagikan kepada tiga kumpulan utama:

1. Amplification (menggunakan kejamakan enzim). Ini termasuk PCR - tindak balas rantai polymerase, yang memainkan peranan penting dalam banyak kaedah diagnostik.

2. Neamplifikatsionnye. Ini kumpulan kaedah dikaitkan secara langsung dengan kerja-kerja campuran asid nukleik. Contoh 3 jenis blots, dalam penghibridan situ, dan lain-lain

3. Kaedah berdasarkan pengiktirafan isyarat daripada molekul siasatan, yang mengikat kepada DNA atau RNA siasatan tertentu. Hybride penyelesaian Sistem Capture sistem penghibridan (HC2) - contoh.

Enzim yang boleh digunakan dalam kaedah penyelidikan biologi molekul

Banyak teknik diagnostik molekul melibatkan penggunaan rangkaian meluas enzim. Di bawah adalah paling kerap digunakan:

1. sekatan enzim - "memotong" molekul DNA untuk bahagian yang diperlukan.

2. DNA polymerase - mensintesis asid molekul deoksiribonukleik dua terkandas.

3. transcriptase Songsang (transcriptase terbalik) - digunakan untuk mensintesis DNA dari template RNA.

4. DNA ligase - bertanggungjawab untuk pembentukan ikatan phosphodiester antara nukleotida.

5. exonuclease - membuang nukleotida dari bahagian akhir molekul asid deoksiribonukleik.

PCR - kaedah asas penguatan DNA

tindak balas rantai polimerase (PCR) digunakan secara meluas dalam biologi molekul moden. kaedah ini, di mana molekul DNA tunggal boleh diperolehi sejumlah besar salinan (molekul menguatkan).

Fungsi utama PCR:

- diagnosis penyakit;

- pengklonan segmen DNA, Gene.

Untuk menjalankan tindak balas rantai polymerase memerlukan elemen-elemen berikut: molekul DNA awal, polymerase DNA thermostable (Taq atau Pfu), fosfat deoxyribonucleotide (sumber asas nitrogen), yang primers (2 primer 1 DNA molekul) dan sendiri sistem penampan yang boleh menjalankan semua tindak balas.

PCR terdiri daripada tiga langkah: penyahaslian, annealing primer dan pemanjangan.

1. penyahaslian. Pada suhu 94-95 darjah Celsius proshodit memecahkan ikatan hidrogen antara kedua-dua rantai DNA, dan hasilnya kita akan mendapat dua molekul tunggal terkandas.

2. primers anil. Pada suhu 50-60 darjah centigrade berlaku primers kesertaan di hujung molekul asid nukleik bebenang tunggal mengikut jenis saling melengkapi.

3. Pemanjangan. Pada suhu 72 darjah adalah anak perempuan disintesis double terkandas molekul asid deoksiribonukleik.

penjujukan DNA

kaedah penyelidikan biologi molekul sering memerlukan pengetahuan urutan nukleotida dalam molekul asid deoksiribonukleik. Untuk menentukan kod genetik disusun. diagnostik molekul masa akan datang akan berdasarkan pengetahuan yang diperolehi dalam penentuan urutan manusia.

Jenis-jenis urutan:

• penjujukan oleh Maxam-Gilbert;
• Sanger penjujukan;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe penjujukan.